ウェスタンブロット プロトコル 転写 条件 抗体 検出

ウェスタンブロット プロトコル

歯科材料由来の試料で同じ条件を回すと、あなたは半日ごと損します。

ウェスタンブロット プロトコルの基本手順

ウェスタンブロットは、SDS-PAGEで分離したタンパク質をPVDFなどのメンブレンへ転写し、一次抗体と二次抗体で目的タンパクを検出する流れです。 ruo.mbl.co(https://ruo.mbl.co.jp/bio/support/method/westernblotting.html)
基本の流れは、分離、転写、ブロッキング、一次抗体反応、洗浄、二次抗体反応、検出です。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
つまり全体設計です。

実務では「とりあえず前回と同じ条件」で進めがちですが、舟越の標準プロトコルでも、アクリルアミド濃度は6〜15％、細胞・組織ライセートの試料量は25〜50μg/lane、精製タンパク質は0.1〜0.2μg/laneと幅があります。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
この幅があるのは、分子量や試料純度で最適値が変わるからです。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
条件最適化が基本です。

歯科医従事者向けの研究では、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞様細胞、炎症関連シグナルを追う場面が多く、目的タンパクの発現量が低いことも珍しくありません。 ptglab.co(https://www.ptglab.co.jp/news/blog/7-tips-for-optimizing-your-western-blotting-experiments/)
そのため、診療後の限られた時間で1回成功させる発想が大事です。
結論は準備段階です。

ウェスタンブロット 転写 条件とメンブレン

転写でまず押さえたいのは、分子量に合わせてゲル濃度を変えることです。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
舟越の資料では、10〜43kDaなら15％、20〜80kDaなら10％、57〜212kDaなら6％が目安です。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
ここが分離の土台です。

小さいタンパク質を粗いゲルで流すと抜けやすく、逆に大きいタンパク質を濃いゲルで流すと移動しにくくなります。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
名刺サイズほどの小さなメンブレンでも、転写が甘いとバンドは簡単にぼやけます。
分子量対応が原則です。

検出試薬は0.6mlで8cm×10cmのメンブレンに使えるとされ、液が均一でないと一部だけ過露光になります。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
均一化に注意すれば大丈夫です。

転写後すぐ使えない日もありますが、標準プロトコルではブロッキング後のメンブレンは-20℃で保存し、1週間以内の使用が案内されています。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
これは意外に便利です。
外来が立て込む歯科系ラボでは、転写まで終えて止められるだけで予定がかなり組みやすくなります。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)

転写原理や装置構成の図解はここが参考になります。
Cytiva｜ウェスタンブロッティングの基礎：原理と手法

ウェスタンブロット 抗体 希釈とブロッキング

ブロッキングは「何でもスキムミルクでよい」と考えられがちですが、実際は抗体や標的によってBSAの方が適することがあります。 blog.cellsignal(https://blog.cellsignal.jp/tech-tips-video-milk-or-bsa-choosing-a-blocking-protein-for-western-blot)
Cell Signaling Technologyも、製品データシートで推奨希釈バッファーを確認すべきと案内しています。 blog.cellsignal(https://blog.cellsignal.jp/tech-tips-video-milk-or-bsa-choosing-a-blocking-protein-for-western-blot)
ここは固定しません。

舟越の標準条件では、5％スキムミルク/PBST（0.2％）で室温1時間、または4℃で一晩のブロッキングが紹介されています。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
一次抗体は4℃で一晩、二次抗体は室温1時間、洗浄は一次抗体後に10分×3回、二次抗体後に10分×4回です。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
回数管理が重要です。

また、細胞・組織ライセートでは一次抗体希釈が1:500〜1:1,000、二次抗体希釈が1:2,500〜1:5,000、精製タンパク質では二次抗体が1:5,000〜1:10,000の目安です。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
二次抗体を濃くしすぎるとシグナルは強く見えますが、背景も一緒に上がって再撮影になりやすいです。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
濃すぎは逆効果ですね。

歯周炎関連や細胞内シグナルのリン酸化タンパクを扱う場合は、ブロッキング剤の選択でノイズ差が出やすいので、ミルク固定で通すより、BSA条件も初回から比較した方が早いです。 ptglab.co(https://www.ptglab.co.jp/news/blog/7-tips-for-optimizing-your-western-blotting-experiments/)
再実験のリスクを減らすなら、狙いは非特異反応の低減で、候補は「抗体データシートを1回確認する」です。 blog.cellsignal(https://blog.cellsignal.jp/tech-tips-video-milk-or-bsa-choosing-a-blocking-protein-for-western-blot)
確認だけ覚えておけばOKです。

ブロッキング剤の考え方を整理するならここが参考になります。
Cell Signaling Technology｜脱脂粉乳かBSAか？ブロッキング剤の選び方

ウェスタンブロット 検出 失敗例と対処

検出では、基質をかけて長く待つほど良いと思われがちですが、舟越の標準プロトコルではCCD撮影の目安が5秒後、20秒後、1分30秒後、5分後と細かく区切られています。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
これは露光の取り逃しを防ぐためです。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
早撮りが有利です。

シグナルが強すぎるときは、試料量を増減する前に二次抗体濃度をさらに希釈する対応が推奨されています。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
25〜50μg/laneの試料を毎回そのまま積むより、抗体系の見直しで改善するケースは少なくありません。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
順番が大事です。

失敗例として多いのは、転写ムラ、洗浄不足、ブロッキング不適合、過露光です。 m-hub(https://m-hub.jp/biology/2120/131)
特に化学発光基質をメンブレン全体へ均一に広げないと、一部だけ白飛びしたような像になり、定性的な評価も不安定になります。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
意外とここです。

歯科系のサンプルでは、石灰化関連タンパクや炎症応答タンパクの発現差を見たい場面が多く、背景が荒れると群間差が見えなくなります。 cellsignal(https://www.cellsignal.jp/learn-and-support/videos-and-webinars/webinar-western-blotting-protocol)
そこで、撮影失敗のリスクを下げる狙いなら、候補は自動撮像装置の露光プリセットをメモ化することです。
それで大丈夫でしょうか？
はい、少なくとも同じ失敗の繰り返しは減らせます。

失敗例と改善の着眼点はここも役立ちます。
M-hub｜失敗例から学ぶウェスタンブロット

ウェスタンブロット プロトコルの再プローブと独自視点

再プローブは「一度検出したら終わり」ではありません。 cytivalifesciences.co(https://www.cytivalifesciences.co.jp/newsletter/protein_sciences/faq/faq0802.html)
標準プロトコルでも、ブロットしたメンブレンは再利用可能で、ストリッピングバッファーの使用が案内されています。 funakoshi.co(https://www.funakoshi.co.jp/contents/1029)
再利用は可能です。

さらにCytivaの解説では、一次抗体の動物種が異なる場合、最初の抗体を完全に除去しなくても、洗浄して再ブロッキングし、次の一次抗体反応へ進める一般的手順が示されています。 cytivalifesciences.co(https://www.cytivalifesciences.co.jp/newsletter/protein_sciences/faq/faq0802.html)
一方で、最初の二次抗体に結合したHRPは完全に失活しないことがあり、2回目の検出に古いシグナルが混ざる点には注意が必要です。 cytivalifesciences.co(https://www.cytivalifesciences.co.jp/newsletter/protein_sciences/faq/faq0802.html)
ここが落とし穴です。

Thermo Fisherの解説では、ストリッピング後に洗浄バッファーまたはブロッキングバッファーで洗ってから化学発光基質を反応させ、シグナルが消えているか確認する方法が紹介されています。 thermofisher(https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/protein-basic6/)
つまり、剥がしたつもりで次へ進まないことが、余計な半日ロスを防ぐコツです。 thermofisher(https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/protein-basic6/)
確認が条件です。

独自視点として、歯科医従事者向けの研究では「診療日程に合わせた膜の分割設計」が効きます。
どういうことでしょうか？
目的タンパクの分子量が十分離れているなら、メンブレンを横方向に切り分けて別抗体で回す設計にすると、再プローブ回数を減らせて、抗体代と日数の両方を抑えやすくなります。 cytivalifesciences.co(https://www.cytivalifesciences.co.jp/newsletter/protein_sciences/faq/faq0802.html)
時間も試薬も痛いですね。

再プローブの考え方はここが参考になります。
Cytiva｜1枚のメンブレンから2種類の抗体で検出する考え方

ストリッピング確認の具体策はここが参考になります。
Thermo Fisher Scientific｜ストリッピング法とリプロービング

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